详解Snapgene软件_分子克隆之利器

 做质粒图谱、直观的查找酶切位点、标记基因片段属性、直观查看引物所在位置，查看开放阅读框所编码氨基酸、直观的序列比对…… Snapgene简直就是做分子克隆的利器。

今天小编就以实验室用的经典版本为例，整理介绍一下snapgene的主要功能和操作流程，希望能帮到各位初接触分子克隆的同僚们。

01建立质粒分析图谱

运行软件，界面如图所示。选择新建dna文件，将从网上得到的序列复制粘贴入框中，命好名字。对于质粒，Topology选择circular（环形），勾选Detect common features，将一些质粒共有的常见的特征加入其中，结果会如下图，

选择add 10 features 就可以生成一个高大上的质粒图谱了。当然，我们也可以直接在诸如addgene这样的网站内上下载现成的dna文件或者gbk文件啦~

（1）MAP视图

在这个视图上我们可以直观的看到很多的信息，包括酶切位点，启动子（promoter），增强子（enhancer），复制起始位点（ori），抗性筛选标记，HA等蛋白标签等等，点左侧的按钮可以选择显示不显示这些信息。在这个图上，酶切位点和引物的位置和相对关系等信息可以说是一目了然，这对于我们在建立克隆时选取酶切位点，测序鉴定克隆时选取测序引物都是十分便利的。

（2）sequence视图

图谱是在MAP视图下看到的结果，我们还可以在sequence视图下来分析序列。这个视图下我们可以很清楚看到序列信息，包括碱基序列信息、由不同的开放阅读框得到的氨基酸序列信息。在这里我们可以自由调整氨基酸的三字母缩写和单字母缩写形式。在这个视图下酶切位点、引物、蛋白标签等参考信息还都是存在的，因此我们在这个视图下设计引物会十分方便。

（3）Enzyme视图与feature视图

Enzyme视图下，我们可以看到各个内切酶的位点和数目，但小编认为这样反倒不如在图谱中看得更直接一些了。

Feature视图下，可以查看常见的的质粒共同特征，除了常见的这些，也可以自己人为的添加特征标签，可以自主的设计特征的类型，特征序列的大小，读取方向，起始位置是否分片段等等。

02设计PCR引物

在多克隆位点处找到合适的两个酶切位点。在目的基因上下游截取15-30bp序列，点击Primers→Add primers。如图：

给该引物命名，然后点击Insertion，在该引物上添加之前选择好的酶切位点序列，如图选择了EcoR I，点击Insert即可完成（必要时需要加保护碱基），还可以在引物上添加多肽标签，如6×His等。最后点击add primer to template，即可完成引物设计与添加。

03序列比对

Snapgene具有序列比对的功能。当测序结果送到，我们需要比对检测我们建立的克隆是否序列正确。如下图所示，先在snapgene中打开你的测序结果，选择View → Align With A Sequence Trace, 然后选取你比对标准文件，比如你的目的基因序列，即可得到序列比对图。

如图是小编的一个测序结果，小编在某蛋白的基因上构建了两个氨基酸的点突变，对点突变质粒的测序比对结果发现有5个错配（mismatch）和1个间断（gap），这些会用红色标出。5个错配就是小编设计的突变位点，而除了这五个之外，其余都是一一对应，表明我点突变得到的质粒只在目标位置有突变，其余都正确，而1个间断是因为小编在蛋白的C端添加了flag标签，而目的蛋白基因到C端即直接是TGA终止密码子，所以有间断，这也是预期内的结果。所以小编建立的点突变是可用的啦~

04模拟建立克隆

Snapgene具有模拟建立克隆的功能，这使得我们设计建立克隆方案更加简便，如果克隆过程设计方案有缺陷，我们可以借助模拟发现并做出纠正。Snapgene可以模拟的标准限制性克隆也可以模拟融合克隆。步骤分别如下

（1）模拟标准限制性克隆：

①打开需要被插入片段的质粒图谱，点击Actions → insert fragments。

②切载体。在质粒中选取合适的酶切位点，单酶切直接点击该酶即可，双酶切则需要按住shfit按键再点击两个酶，这样即完成载体的酶切；

③切目的基因片段。选取insert→source of insert，将需要插入的目的基因片段序列文件加入其中，在目的基因片段中选取同样的两个酶进行酶切，必要时点击调整方向使其匹配，点击clone完成模拟。

（2）模拟融合克隆

 打开需要被插入片段的质粒图谱，点击Actions →in-fusion ®cloning →insert one fragments。

①在vector 选项卡，选取要插入的位点或者要替换的区域。在这里，小编准备随意替换掉质粒上的抗性bla（β-内酰胺酶）区域，选取该段。

②在fragment选项卡，选替换片段，注意该片段阅读方向与被替换质粒位点的方向是否一致，如不一致，点击更换方向。这里小编选取卡那抗性。

③在product选项卡点击Choose Overlapping PCR Primers，即可设计好引物，形成融合后的质粒图谱。可以看到原来的β-内酰胺酶区域已经被替换成了卡那抗性标记。

若想获得引物的序列，点击Primers→Export Selected Primers，选择保存。

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