SnapGene模拟TA或GC克隆

如何在SnapGene中模拟TA/GC克隆?  

TA克隆用于PCR产物的克隆。由于Taq聚合酶(和其他一些聚合酶)的末端转移酶活性，它利用了由添加3'A核苷酸产生的粘性末端悬垂。这些悬垂使退火和连接成为具有互补3'T悬垂的线性化向量。GC克隆是类似的，并且基于Taq实际上添加了3'a和3'G悬垂的混合物的发现。  

SnapGene提供了一个常用的TA和GC克隆载体库。  

打开一个包含插入序列的文件  

打开一个序列文件。如果要克隆的区域被标注为一个特征，则单击该特征以选择它。  

如果区域没有标注，那么切换到Sequence视图并选择要放大的特定区域。  

启动TA或GC克隆工具  

如需执行TA克隆，请单击操作→TA或GC克隆→TA克隆  

如需执行GC克隆，请单击操作→TA或GC克隆→GC克隆  

在本文中，我们将模拟TA克隆。所描述的所有步骤也适用于GC克隆。  

 

克隆工具打开，显示插入面板。在最前面的打开序列文件中选择的区域将被自动选择为要克隆的插入。  

如果您希望更改插入源，请单击“插入源”下拉菜单并选择替代源文件，然后选择插入区域。  

使用下拉菜单设置用于PCR的聚合酶。通常您会使用聚合酶产生3'悬垂†。  

†如果您选择使用产生钝端的聚合酶进行PCR，那么您将需要在PCR后模拟添加3'悬垂，请参阅下方章节‘PCR后添加悬垂‘。  

选择矢量  

 

切换到“线性化矢量”面板，从“商业线性化矢量”列表中选择一个矢量。  

如果您希望使用“自定义线性化”矢量，则使用下拉菜单从序列集合中选择自定义矢量。  

设计PCR引物  

 

切换到“产物”面板，点击“选择PCR引物”，设置新引物的目标Tm（熔链温度），点击“选择引物”。新的PCR引物将被添加到序列中。  

切换到“插入”面板并命名新的引物(可选)。  

为新的质粒产物输入一个合适的名称。  

对于TA或GC克隆，将始终显示一个警告:TA克隆是一个非定向过程，因为插入可能以正向或反向方向连接到向量。  

在正向和反向方向模拟克隆  

 

取消选中“并关闭此窗口”选项  

为第一个新产物质粒设置一个合适的名称。  

单击Clone创建新的质粒序列。  

 

将打开新的未保存的产物序列。单击File→Save将新序列保存到计算机上的适当位置。  

切换回TA克隆窗口，切换“插入方向”，给新产物一个合适的名称，然后单击Clone  

将创建一个新的未保存的“反向”产物序列。单击File→Save将序列保存到计算机上的适当位置。  

查看新文件的历史记录以查看模拟克隆步骤  

选择“product”文件并切换到“History”视图，以查看TA或GC克隆过程中模拟的所有步骤。  

PCR后添加悬垂  

如果您遵循上述步骤，但选择“创建钝端”(例如，如果选择使用比Taq聚合酶具有更高保真度的聚合酶来扩增PCR产物)，那么您将需要模拟PCR后添加悬垂。  

设计好引物后，点击Add3’AoverhangtoInsert，模拟用Taq聚合酶处理PCR产物增加Aoverhang(A-tailling)，然后单击Clone  

 

一个额外的“编辑DNA末端”步骤表示添加到PCR产物的A悬垂将出现在产物历史视图中。

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