SnapGene怎么用

　　SnapGene软件概述

　　SnapGene常被用于分子生物学实验中各种分析。例如包括DNA序列、质粒图谱、引物设计、模拟琼脂糖凝胶电泳、序列比对等操作，对于后续实验结果的分析十分便捷。以下是SnapGene软件常用分析的一些分享（SnapGene软件版本为6.0.2）。

　　1、引物设计

　　包括目的片段合成引物、qPCR引物（NCBI）的设计等均能方便设计；并生成理想的序列，具体操作如下：

　　（1）利用NCBI库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询需要设计引物的CDS，输入基因名称，一般选择“Gene”数据库，此时需要选择物种来源包括“human”、“Mouse”等等，如图2-1-1所示。

　　（2）例如输入基因名称如“PTENhuman”，点击Search，获取基因详情页面如图2-1-2所示。

　　

　　图2-1-1Gene查找

　　

　　图2-1-2PTENgene详情

　　（3）直接滑动页面至“PTENhuman”或点击右边的“NCBIReferenceSequences(RefSeq)”查找以“NM_”开头的mRNA序列，并点击进入，如图2-1-3所示。

　　

　　图2-1-3CDS区查找

　　（4）滑动页面找到编码序列（CDS），接着点击“CDS”并滑动页面至顶端，查看已选中基因区域例如846-2057bp如图2-1-4所示，然后选择“FASTA”，选中并复制编码区序列（CDS），如图2-1-5所示。

　　

　　图2-1-4FASTA序列范围

　　

　　图2-1-5FASTA序列

　　（5）打开SnapGene软件，点击“新建DNA或RNA文件”，接着粘贴从NCBI复制的CDS序列并重新命名PTEN，如图所示2-1-6所示。

　　

　　图2-1-6新建DNA文件

　　（6）接着，选择“可以”获得导入序列的图谱如图2-1-7所示。

　　

　　图2-1-7导入序列图谱

　　（7）点击窗口底部“序列”，切换至导入基因的DNA序列，如图2-1-8所示，此时可为该序列进行引物设计。

　　

　　图2-1-8基因序列

　　（8）正反向引物设计：选择序列首选或者末端18~35bp，点击“引物”—“添加引物”—“选择顶部链或底部链”—“命名引物”—“添加引物至模板”，如图2-1-9所示。

　　

　　图2-1-9引物设计

　　（9）点击窗口底部“引物”，查看引物详情，如图2-1-10所示。

　　

　　图2-1-10引物详情

　　（10）另外，当目的基因引物获取与质粒图谱的酶切位点密切相关时，SnapGene软件可快速获取并添加引物的酶切位点，如点击“酶（N）”—“限制性酶（例如NotI、XhoI）”—“复制识别序列”—“双击正向引物”—“编辑引物添加酶切位点”，重新获取引物，如图2-1-11所示。

　　

　　图2-1-11载体-目的基因引物获取

　　（11）引物优化：添加保护碱基G或者C调节退火温度Tm，通常地Tm一般为58~60℃左右等。遵循引物设计原则，G-C含量控制在40%-60%左右；通过删除碱基等优化引物长度例如长度一般在18~35bp，添加碱基调整所选序列，重新获取引物。通过Primer-BLAST，PCR等手段检测引物有效性。

　　2、质粒图谱的打开、编辑

　　以PcDNA3.1（+）为例：

　　（1）选择“打开文件”，打开PcDNA3.1（+）质粒图谱，如图2-2-1所示。

　　

　　图2-2-1PcDNA3.1（+）质粒图谱

　　（2）查看载体序列，酶切位点分析等，如图2-2-2所示。

　　

　　图2-2-2PcDNA3.1（+）质粒序列

　　（3）PCR模拟：点击“行动”中选择“聚合酶链式反应PCR”，添加已设计的引物并为产物命名后保存文件，即可模拟PCR扩增过程，如图2-3-1所示。

　　

　　图2-3-1PCR模拟过程

　　（4）质粒构建模拟：打开构建所需质粒PcDNA3.1（+），点击“行动”—“限制和插入片段克隆”—“插入片段”。在“载体”/“片段”处：首选分别选择“载体”/“片段的来源”—PcDNA3.1(+).dna/PTEN.dna，接着分别选择酶切位点（NotI、XhoI），同时可查看克隆过程并对克隆产物进行命名。最后点击“克隆”可模拟质粒构建过程，如图2-4-1~3。

　　

　　（5）琼脂糖凝胶电泳模拟过程：选择“工具”—“模拟琼脂糖凝胶电泳”—选择所需电泳产物并点击“可以”如图2-5-1~3所示；获得模拟的琼脂糖凝胶电泳图；此外，还可以通过手动更改Marker、泳道数目以及琼脂糖凝胶电泳的类型、浓度等。

　　

　　（6）测序、多序列比对：Snapgene也常常用于质粒构建后的序列比对。例如成功构建质粒后送至测序公司测序，测序公司会返回正反向测序后的序列如正向引物（T7）-seq.和反向引物（BGH）-seq.。点击“》”—“显示比对”—“比对到参考序列”—选择“比对开放序列”—点击“可以”或者选择“工具”—“比对到参考序列”—选择“比对开放序列”，即可以对克隆片段进行碱基比对并查看比对结果，如图2-6-1~4所示。

　　

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